第十三章 色谱法引论
Introduction to Chromatography
13.1 概述
色谱法自提出至今已有100多年的时间。1903年，俄国植物学家茨维特（Tswett，1872-1919）在一次学术演讲中发表了他的实验发现，第一次描述了色谱分离的过程和现象。1906年，他发表了两篇应用色谱法分离植物色素的学术论文，并正式提出了“色谱法”这样一种分离方法。茨维特将植物叶片的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管（称为色谱柱）中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离（图13.1）。
图13.1 植物色素分离示意图
茨维特将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。但在此后的20多年里，很少有人应用这一技术用于分离混合物。直到1931年，Kuhn等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此，色谱法开始为人们所重视。1942年，汉斯（Hesse）以氮气为流动相，硅胶为固定相，分离了当时很难分离的苯与环已烷。马丁（Martin）和欣格（Synge）则将液体有机化合物涂渍在多孔性固体表面上作为固定相，被分离组分通过分离柱时在气-液两相间进行分配，不但使色谱法分离能力提高了很多，而且有机固定相的使用也使得分析对象的范围极大扩展，并建立了系统的色谱分析理论，极大的推动了色谱分析法的发展。二人由此而获得了1952年诺贝尔化学奖。在此之后，色谱的分离理论及相关技术发展很快，相继出现了各种色谱分析方法。
在仪器分析领域，色谱法是一个相对出现较晚的分支学科。早期的色谱技术只是一种分离技术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多，较少用于定量分析。当这种高效的分离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起，克服传统光学分析方法、质谱分析法的缺点，即分析之前需要复杂的样品处理和分离过程，因而成为最重要的一种分析方法，几乎可以分析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用，不管是气体、液体还是固体样品，都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段，因此，色谱法也被称之为分离分析法，是目前仪器分析方法中发展速度最快，应用最为广泛的分析方法之一。
色谱分析法在化学、生物、医学等各学科中均有广泛的应用，表13.1为色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作。
表13-1 色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作
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年代 |
获奖学科 |
获奖研究工作 |
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1937 |
化学 |
类胡萝卜素化学，维生素A和B |
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1938 |
化学 |
类胡萝卜素化学 |
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1939 |
化学 |
聚甲烯和高萜烯化学 |
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1950 |
生理学、医学 |
性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离 |
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1951 |
化学 |
超铀元素的发现 |
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1955 |
化学 |
脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素 |
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1958 |
化学 |
胰岛素的结构 |
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1961 |
化学 |
光合作用时发生的化学反应的确认 |
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1970 |
生理学、医学 |
关于神经元触处迁移物质的研究 |
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1970 |
化学 |
糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用 |
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1972 |
化学 |
核糖核酸化学酶结构的研究 |
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1972 |
生理学、医学 |
抗体结构的研究 |
从表13.1中可以发现，一旦茨维特的理论为科学界所广泛接受和掌握，马上产生了大量的研究成果并推动了相关学科的产生和发展，这也充分说明了色谱法的重要作用和广泛的应用范围。
（1）分离效率高。几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无法实现的复杂样品分析。随着色谱分析技术的发展，现代的二维色谱甚至一次分析可以得到上万种化合物的含量和结构信息。
（2）分析速度快。一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。
（3）检测灵敏度高。随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10
（4）样品用量少。一次分析通常只需数纳升至数微升的溶液样品。
（5）选择性好。通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分物质。
（6）多组分同时分析。在很短的时间内（20 min左右），可以实现几十种成分的同时分离与定量。
（7）易于自动化。现代色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。
色谱法的主要不足是定性能力较差。为弥补这一不足，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用，如色谱法与质谱法的联用，色谱法与红外光谱法的联用等。
色谱法又称色层分析法或分离分析法，是一种物理化学分析方法，它利用试样中共存组分间的吸附、分配、交换、迁移速率以及其他性能上的差异，先将它们分离，而后通过检测器按一定顺序进行分析测定。
色谱法的种类很多，它们共同的特点是都具备两个相，有一相固定不动，称为固定相；另一相携带样品移动，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上有差异，与固定相相互作用的方式、强弱就会有差异，因此在同一推动力下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。
色谱法的固定相可以是固体或者液体，也可以将液体涂在固体的表面甚至是通过化学反应键合在固体的表面。流动相是与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。流动相可以是液体、气体或者是超临界流体（supercritical fluid，简称SCF）
由于固定相和流动相各不相同，分离的过程也有不同的机制，使得色谱法的分类方法较多。
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。
液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。
根据组分与固定相的相互作用，可将色谱法分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法等。
（1）吸附色谱法 吸附色谱法通常也被称为液－固吸附色谱法，其固定相是一种吸附剂，利用其对试样中待分离组分吸附能力的差异，而实现试样中各组分分离的色谱法。吸附剂通常是具有较大表面积的活性多孔固体，例如硅胶、氧化铝和活性炭等。早期茨维特用来分离植物色素的方法就是一种吸附色谱法。
（2）分配色谱法 分配色谱法的固定相是液体，或将液体固体相键合在多孔性固体上，利用液体固定相对试样中各组分的溶解能力不同，即试样中各组分在流动相与固定相中分配系数的差异，而实现试样中组分分离的色谱法。
（3）离子交换色谱法 以离子交换树脂作固定相，在流动相带着试样通过离子交换树脂时，由于不同的离子与固定相具有不同的亲合力而获得分离的色谱法。离子交换色谱法不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。
（4）凝胶色谱法 凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。对于分子大小不同的各种分子，在凝胶色谱柱中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，而分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用了凝胶的“分子筛效应”而将分子量不同的物质进行分离。
（5）亲和色谱法 利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。
固定相装在柱内的色谱法称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法称为平板色谱。根据平板色谱的载体，又可将之分为薄层色谱和纸色谱。
13.2色谱流出曲线及有关术语
色谱流出曲线也称之为色谱图（Chromatogram）。在色谱法中，当样品加入后，样品中各组分随着流动相的不断向前移动而在两相间反复进行溶解、分配，或吸附、解吸的过程。如果各组分在固定相中的分配系数（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能达到分离。分配系数小的组分滞留在固定相中的时间短，在柱内移动的速度快，先流出柱子；分配系数大的组分滞留在固定相中的时间长，在柱内移动的速度慢，后流出柱子；分离后的各组分经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。
色谱图事实上就是色谱柱流出物中溶质浓度随时间的变化曲线，直线部分是没有溶质流出时流动相的背景响应值，称之为基线（base line）。在基线平稳后，通常将基线响应值设定为零，再进样分析。溶质开始流出至完全流出所对应的峰型部分称色谱峰（peak），基线与色谱峰组成了一个完整的色谱图（图13.2），其中1，2，3，4为色谱峰，3和4之间的平直部分为基线。
图13.2 典型色谱流出曲线
色谱峰是经过色谱柱分离后的组分流经检测器时所产生连续信号曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯分布曲线）（图13.3）。
图13.3 色谱峰示意图
色谱的定性与定性分析均需要利用色谱峰的各种参数，同时，一个色谱分析结果的优劣程度也与色谱峰的参数密切相关，因此，如何描述一个色谱峰，并为定性分析和定量分析提供依据，对于色谱分离过程是很重要的。
在色谱图中，当没有样品进入检测器所给出的流出曲线称为基线。通常的正常基线是一条平行于横轴的直线，其平直程度反应了仪器及操作条件的稳定程度。基线的高低主要由流动相中的杂质等因素决定。
如果将基线放大，可以发现平直的基线其实也有很多微小的起伏，这些未知的偶然因素引起基线起伏的现象称为噪声（noise）。噪声的大小可用噪声带（峰-峰值）的宽度来衡量。如果噪声的水平较低，则有利于微量和痕量物质的定量分析，如果噪声的水平高，则相应的分析最低检出浓度会增大。噪声分短期噪声和长期噪声两种。如果基线随时间变化而朝某一方向缓慢变化，称为基线漂移。漂移用单位时间基线水平的变化来衡量，通常是由于实验条件不稳定所引起的。如图13.4中(a)和(b)所示，分别为短期噪声和长期噪声，图(c)为漂移。漂移往往会造成实验结果不能重复，因此，在开始实验之前，要将基线漂移降低到不影响实验结果的程度。
图13.4 噪声和漂移示意图
色谱峰可用峰高、峰宽、峰面积3个参数来描述。峰高和峰面积用于定量，峰宽用于衡量色谱分离效率。若是描述一组色谱峰，还需用分离参数表述相邻峰的重叠程度。
2.峰高h
自基线至色谱峰的顶点之间的距离，称为峰高。
3.峰宽
峰宽即色谱峰的区域宽度，是色谱流出曲线中一个重要的参数，反映了色谱分离的动力学过程及色谱分离效率的高低。从色谱分离角度考虑，希望区域宽度越窄越好。通常度量色谱峰区域宽度有下列三种方法（图13.3）：
（1）标准偏差
σ 为0.607 倍峰高处色谱峰宽度的一半。
（2）半峰宽度 (W 1/2 ) 又称半宽度或半高峰宽，即峰高为一半处的宽度，它是通过峰高的中点作平行于峰的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半，它与标准偏差的关系为：
（13.1）
（3）峰底宽度W：自色谱峰两侧的转折点所作切线在基线上的截距，它与标准偏差的关系为：
W
= 4σ
（13.2）
4.峰面积A
色谱峰与基线之间包含的面积称为峰面积。峰面积和峰高是色谱图上最基本数据，它们的测量精度将直接影响定量分析的精度。由于现代绝大部分色谱仪器都配备了积分仪（色谱数据处理机）或色谱工作站，可以方便的给出峰面积，所以关于峰面积的手工计算本书不再详述。
在实际的色谱过程中，溶质从色谱柱中流出时，只有很少的色谱峰符合高斯分布曲线，大部分具有一定的不对称性。我们可以定义一个不对称因子f来定量地表示色谱峰的不对称程度（图13.5），将10％峰高处的宽度AC与10%峰高处前半峰的宽度AB的2倍的比值定义为不对称因子f，即
（13.2）
图13.5 色谱峰的不对称因子示意图
5.不正常色谱峰
不正常的色谱峰主要为拖尾峰和前沿峰。
（1）拖尾峰 不对称因子大于1.05称为拖尾峰。色谱峰的形状是前半部分信号增加快，后半部分信号减少慢。引起峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在吸附作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。
（2）前沿峰 又称为伸舌峰，是不对称因子小于0.95的色谱峰。他的前半部分信号增加慢，后半部分信号减小快。因为前沿峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
在整个色谱分离过程中，流动相始终是以一定的流速（或压力）在固定相中流动的，并将溶质带入色谱柱。溶质因分配、吸附等相互作用，进入固定相后，即在固定相表面与活性位点相互作用，从而在固定相中保留。同时，溶质又被流动相洗脱下来，进入流动相。与固定相作用越强的溶质在固定相中的保留值就越大。保留值是组分在色谱体系中的保留行为，反映了组分与固定相作用力的大小，是色谱过程热力学特性的参数
保留值可以时间表示，或者以流动相的体积表示。以时间表示的称为保留时间，以体积表示的称为保留体积。
1.死时间t0
死时间是指不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间，以t0表示。死时间正比于色谱柱的空隙体积，因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相同。
2.保留时间tR
被分离试样从进样到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也就是从进样开始到出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，用tR表示，常以分（min）或秒（sec）为时间单位。保留时间是由色谱过程中的热力学因素所决定，在一定的色谱操作条件下，任何一种物质都有一确定的保留时间，是组分本身所固有的性质，可以作为色谱定性分析的依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。
3.调整保留时间tR´
某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，也称为真实保留时间，溶质保留时间，其表达式为
tR´=
tR
- t0
（13.3）
调整保留时间反映了被分析的组分与色谱柱中固定相发生相互作用而在色谱柱中滞留的时间，可以看作是被固定相滞留在色谱柱中的时间，因而调整保留时间更确切地表达了被分析组分的保留特性，是色谱定性分析的基本参数之一，比保留时间定性更为可靠。
4.死体积V0
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，以V0表示。当管路体积检测器的空间很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的流动相的体积流速（mL·min-1）计算。
V0 = t
5.保留体积VR
指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积，以VR来表示。保留时间与保留体积关系为：
VR= tR F
（13.5）
6.调整保留体积VR¢
某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。
VR¢ =
VR
- V0 =
tR¢ F
（13.6）
7.相对保留值r2,1
某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。
r2,1 = tR2 ¢ / tR1´
= VR2¢ / VR1¢
（13.7）
由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号a表示，即
a = tR¢(i) / tR¢(s)
（13.8）
式中tR
¢(i)为后出峰的调整保留时间，所以a总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。
色谱法主要利用各组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同以达到分离的目的。在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡称为分配平衡，为了描述这一分配行为，通常采用分配系数K和分配比k来表示。
分配色谱分离的过程就是样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，可以用组分在两相间的分配来描述。分配系数是在一定温度和压力下组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比值，即
（13.9）
分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一组分的特征值。分配系数是分配色谱中的重要参数，如果两个组分的分配系数相同，则它们的色谱峰重合；反之，分配系数差别越大，则相应色谱蜂分离得越好。
分配比又称容量因子，指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，固定相和流动相中的组分的质量比，即
（13.10）
k值大小取决于组分本身和固定相的热力学性质，它不仅随柱温、柱压变化，也与流动相及固定相的体积有关。k值是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数，是组分与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，k值越大，组分在固定相中的量越多，柱的容量越大，保留时间越长，因此k又称为容量因子、容量比或分配容量；k为零时，则表示该组份在固定液中不溶解，因而不能被色谱柱所保留，其保留时间等于死时间。
两组分的相对保留值α决定于分配系数K或分配比k，三者之间的关系如下：
（13.11）
上式表明：如果两组分的K或k值相等，则α＝1，两个组分的色谱峰重合；两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。
13.3
色谱法基本原理
色谱分离理论研究物质在色谱过程中的热力学和动力学规律，如解释色谱流出曲线的形状、谱带展宽的机理，从而为选择和优化色谱分离条件提供理论指导。色谱分离理论用严格的数学公式表述，需要根据溶质在柱内的迁移过程及影响这一过程的各种因素，列出相应的偏微分方程组，求出描述色谱谱带运动的方程式。其数学处理相当复杂，方程组的求解也非常困难。在实际研究中，通常要进行适当的条件假设并作简化的数学处理。本节主要介绍色谱分离的塔板理论及速率理论。
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论，它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：
（1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
（2）样品首先加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
（3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。
（4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的的量无关。
塔板高度用H表示。经过多次平衡，分配系数小的组分，先离开色谱柱，分配系数大的后离开色谱柱。由于色谱柱内的塔板数相当多，即使组分的分配系数即使只有微小差别，仍可获得较好的分离效果。
理论塔板数用n表示，当色谱柱长为L时，其塔板数n为
（13.12）
当L确定时，n越大，或H越小，表示柱效率越高，分离能力越强。
由塔板理论可求出理论塔板数n的计算公式
（13.13）
式中，tR为组分的保留时间，W为峰底宽度。
通常使用的高效液相色谱柱的理论塔板数n每米超过10000以上，理论塔板高度H在
由于死时间t0包括在tR中，而实际死时间不参与柱内的分配，所以n值尽管很大，H很小，但与实际柱效相差很大，因而提出了将死时间t0扣除的有效理论塔板数neff和有效塔板高度Heff作为柱效能指标
neff=5.54
=16
（13.14）
Heff=
（13.15）
同一色谱柱对不同物质的柱效是不同的，因此在说明柱效时，除注明色谱条件和色谱柱外，还应指出是对何物质而言的。
塔板理论指出了组分在柱内分布的数学模型。组分随着流动相冲洗时间的增加，在柱内迁移过程中浓度呈正态分布谱图。它形象地说明了色谱柱的柱效，理论塔板数是反映柱效能的指标。理论塔板数n的物理意义在于说明组分在柱中反复分配平行的次数的多少，n越大，平衡次数越多，柱效越高，组分之间的热力学性质差异表现得越充分，组分与固定相的相互作用力越显著，分离得越好。反之，n越小，平衡次数越少，柱效越小，组分之间的热力学性质的差异难以充分表现，分离得越差。
塔板理论还能很好地解释色谱图，如曲线形状、浓度最大值位置、数值和流出时间，色谱峰的宽度和保留值的关系等。因此，塔板理论具有一定的实用价值。
但是，塔板理论把色谱柱作为蒸馏塔或蒸馏柱来看待，它的几个假设并不符合色谱柱内的情况。组分在塔板高度H内在两相间的质量传递需要一定时间，分配平衡不可能达到瞬时完成，而且在柱前部分和柱后部分的一个塔板高度H内，组分的分配平衡是有差异的，达不到完全平衡；分配系数K在每个塔板上不是一成不变的常数；组分和流动相在柱内的流动也不是以跳跃式或脉冲方式进入一个体积，而是连续式的进入。组分的沿轴向的扩散也是不可忽略。因此，塔板理论具有一定的局限性，它不能解释同一色谱柱对不同组分理论塔板数n或塔板高度H可能不同；不能解释不同操作条件下，同一色谱柱对相同组分的理论塔板数n或塔板高度H的不同；不能找出影响n或H的内在因素；不能为操作与应用色谱方法提供改善柱效的途径和方法。这是因为塔板理论只考虑组分热力学因素，而没有考虑组分在柱内的动力学因素。塔板理论无法解释柱效与流动相流速的关系，也不能说明影响柱效有哪些主要因素，这是塔板理论局限性的主要原因所在。
为了克服塔板理论的缺陷，1956年荷兰学者范弟姆特（Van Deemter）等在Martin等人工作的基础上，提出了色谱过程动力学理论——速率理论，比较完整地解释了色谱的分离过程。后来，Giddings等又作了进一步的完善。速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。该理论模型对气相、液相色谱都适用。速率理论可用范第姆特方程进行描述，其数学简化式为
（13.16）
式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散相系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。
13.3.2 .1 涡流扩散项A
在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，组分分子在前进中形成紊乱的涡流，故称为涡流扩散（图13.6）。
图13.6 涡流扩散示意图
在填充柱内，由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使同一组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱，一些分子沿较短的路径运行，较快通过色谱柱，另一些分子沿较长的路径运行，发生滞后，结果使色谱峰变宽。其程度由下式决定
（13.17）
上式中，λ为固定相填料的不规则因子，dp为固定相填料的平均直径。
从上式可以看出，涡流扩散相与固定相的颗粒大小、几何形状及装填紧密程度有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减小涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是提高柱效的有效途径。随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的理论塔板高度H也越小，色谱柱的柱效也越高。因此，色谱柱中装填固定相的粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要的因素，但固定相的粒度也不能无限制的减小，因其阻力会随着粒度的减小而迅速增大。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A=0。
13.3.2 .2 分子扩散项B/u（纵向扩散项）
当样品组分被载气带入色谱柱后，以“塞子”的形式存在于柱的很小一段空间中，由于存在纵向的浓度梯度，因而就会发生纵向扩散，引起色谱峰展宽（图13.7）。分子扩散项系数为
（13.18）
式中，g是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，称为弯曲因子。Dg为组分分子在流动相中的扩散系数（cm2·s-1）。
图13.7
分子扩散示意图
弯曲因子与填充物性质有关，由于在填充柱内有固定相颗粒存在，使分子自由扩散受到阻碍，扩散程度降低。而在空心柱中，扩散不受到阻碍，g=1。
由式13.18可知，分子扩散项一般与下列因素有关：
（1）与组分在流动相中的扩散系数Dg成正比。Dg与流动相及组分性质有关，分子量大的组分Dg小，Dg反比于流动相分子量的平方根。Dg与柱温、柱压有关，随柱温升高而增大，随柱压增大而减小。所以采用分子量较大的流动相，控制较低的柱温，可使B项降低。
（2）与组分在色谱柱内停留的时间有关，流动相流速小，组分停留时间长。因此气相色谱采用较高的载气流速以减小分子扩散项。
对于液相色谱，组分在流动相中的纵向扩散可以忽略不计。
13.3.2 .3 传质阻力项Cu
组分在固定相和流动相之间的分配必然有一个组分分子在两相间的交换、扩散过程，这个过程称为质量传递，简称传质。以气液分配色谱为例，当组分进入色谱柱后，由于它对固定液的亲和力，组分分子首先从气相向气液界面移动，进而向液相扩散分布，继而再从液相中扩散出来进入气相（图13.7）。这个过程叫做传质过程。传质过程需要时间，而且在流动状态下，不能瞬间达到分配平衡。当它返回气相时，必然落后于随流动相前进的组分，从而引起色谱峰变宽。这种情况就如同这一部分受到了阻力一样，因此称为传质阻力，用C表示。
图13.7传质阻力示意图
（1）对于气液色谱，气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行浓度分配。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为
Cg=
（13.19）
气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。因此，采用粒度小的填充物和分子量小的载气，可使Cg减小，提高柱效。液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，达到平衡后再返回相界面的传质过程。液相传质阻力系数Cl为
Cl=
（13.20）
固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小。降低液膜厚度df，但同时也会减小k，又会使Cl增大。所以可采用增大比表面积的方法（减小粒度）来减小Cl。但比表面积太大，又会造成拖尾峰。一般可通过控制适宜的柱温来减小Cl。对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即
C=Cg+Cl
（13.21）
（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs，即
C=Cm+Cs （13.22）
对于Cm，固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速率就愈快，柱效就愈高。对高效液相色谱固定相的设计就是基于这一考虑。
对于Cs，传质过程与液膜厚度平方成正比，与试样分子在固定液的扩散系数成反比。
测定不同流速下的塔板高度H，可作气相色谱和液相色谱的H-u的曲线图，可得到如下的两条曲线（图13.8）。
可见，气相色谱和液相色谱的柱效能与流速的变化关系有相同之处也有不同之处。
液相色谱中的纵向扩散非常小，u和H的关系较简单。这是因为液相色谱的纵向扩散系数和传质阻力系数都与气相色谱有所不同。液相色谱的范第姆特方程式表示为
（13.23）
式中Dm为组分在洗脱液中的扩散系数，δ和σ分别为常数。因纵向扩散B/u在液相色谱中很小，所以塔板高度H主要由传质阻力项Cu决定，也即流速越大，H越大。而在气相色谱中的纵向扩散明显，在低流速时，纵向扩散尤为明显，在此区域，增大流速可以使H降低，如图13.9所示。但随着流速增大，传质阻力增加了，所以在高流速区，Cu项对H的影响更大一些，随着u的增加，H也增大了。在气相色谱中的H－u曲线上存在一个最低点，即对应于u最佳和H最小的一点，而液相色谱的H-u曲线上几乎没有这一转折现象。
气相色谱中的最佳流速可以通过实验和计算方法求出。将式(13.16)微分得
dH
/du
= －B / u2
+ C = 0
B / u2
= C
u最佳 = 
(13.24)
H最小 = A + 
+= A + 2 (13.25)
其中的A、B、C的数值可以在一定的色谱条件下测得三种不同流速下对应的H值，再根据式(13.25)组成一个三元一次方程式，进而求出H最小和u最佳。
除流速以外的其它因素如柱温、固定液的性质和用量、载体的粒度等对柱效能和分离度的影响将在后面的章节中论述。
13.4 分离度
在色谱分析中常常遇到的是难分离物质对的分离问题。欲将难分离物质对的两组分进行分离，首先是两峰间的距离要大，即两组分保留时间有足够大的差值；其次是峰要窄。选择性反映了色谱柱对物质保留值的差别，柱效率反映了峰扩展的程度，但都不能表示色谱柱的总分离效能。为了综合考虑保留值的差值和峰宽对色谱分离的影响，需要引入分离度的概念。
13.4.1
分离度定义
在多组分的色谱分离过程中，经常出现色谱峰部分重叠，甚至是完全重叠的情况。如图13.10所示，图a分离较理想，两色谱峰距离较远且峰形较窄，两峰无重叠，这表示选择性和柱效都很好。图b，虽然两色谱峰距离较近，但峰形仍很窄，说明选择性一般，但柱效很高。图c两峰之间虽然距离较远，但色谱峰很宽，说明选择性虽好，但柱效很低。图d的分离度很差，而且选择性也不好。
图13.10 分离度与选择性及柱效之间的关系
由此可见，单独用柱效或选择性不能真实地反映组分在色谱柱中分离情况，故引入一个综合性指标分离度R，又叫分辨率，它是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。要求它既能反映柱效又能反映选择性的指标。两峰间的分离程度受两峰间的距离和两峰各自峰宽的制约。若保持峰宽不变，加大峰间的距离则分离程度加大，即分离度与两峰的保留时间之差成正比；若保持两峰间距离不变，使峰的宽度减小，两峰分离宽度也将增大，即分离度与峰宽成反比。因此，分离度为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽之和一半的比值。
图13.11 分离度示意图
图13.11中，两色谱峰的保留时间分别为tR1和tR2，其峰底宽度分别为W1和W2，则其分离度：
（13.26）
一般认为，当分离度R>0.75（图13.13）时，两峰有部分重叠，但定性分析不受太大影响；当R=1时，峰有2%的重叠，分离程度可达98%，这已适合大多数定量分析的需要；当R=1.5时，分离程度可达99.7%，可以认为两峰已完全分开了。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。若R值更大，分离效果会更好，但会延长分析时间。
图13.12
不同分离度下两峰的重叠情况
在峰形不对称，或者两峰之间有重叠时，峰底宽度很难直接测定，此时可用半峰宽代替峰底宽，并认为W≈2W1/2,则公式变形为
（13.27）
分离度是评价一个色谱分离过程以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据。在计算R值时，组分的保留值与峰底宽度要采用相同的计量单位。两峰的保留值相差越大，峰越窄，分离度越大。但分离度的影响因素较多，柱效、选择性、容量因子等都与分离度有关系（图13.13）。因此，有必要对分离度与各参数之间的关系式进行探讨。
图13.13 影响分离度的各种因素
13.5 基本色谱分离方程式
分离度概括了色谱过程动力学和热力学特性，是衡量色谱柱分离效能的总指标。但分离度的定义公式并不能给出分离条件会如何影响分离结果，无法作为改善分离的根据。我们必须知道分离度与色谱分析中的重要参数如柱效n、容量因子k和选择因子α之间的关系，从而通过控制这些参数来改善分离效果，达到我们所希望的分离度。
设有两个性质相近组分的色谱峰1和2，体系的死时间为t0，保留时间为别为tR1和tR2，峰底宽度为W1和W2，根据容量因子的定义式：
可以得到
对于组分1和组分2，则有
因两组分的性质相近，可以假定两组分峰宽相等，W1=W2，则其分离度为：
因组分1和组分2性质相近，保留时间相近，且峰底宽度相同，则其理论塔板数也相同，以n表示。
由此可得到：
代入分离度公式，得到：
两组分的性质相近，则其分配系数也近似相同，则
（13.28）
式13.28为基本色谱分离方程式，是色谱法中最重要的方程式之一，公式的第一项、第二项和第三项分别说明了分离度R与重要色谱参数柱效n、容量因子k以及选择因子α之间的关系。
用分离度公式可以计算给定体系所能达到的分离度。由于理论塔板数n与柱长L成正比，由此可以计算出某一分离度所需要的色谱柱长。通常都希望计算要达到某一预定的分离度所需要的理论塔板数或有效理论塔板数。为此，上式可改写为
（13.29）
由上面各式可得到
（13.30）
（13.31）
说明用较长的柱子可以提高分离度，但较长的色谱柱不但增大了分离的阻力，也延长了分析时间，对大量样品的分析不利。
在色谱分析中，总是希望在较短的时间内获得较高的分离度。究竟要多大的分离度，要根据分析任务来决定。一般说来，在进行定性分析时，需要准确测量tR值，对分离度的最低要求是R=0.8，在用峰高法进行定量分析时，要求R大于1.0；若用测量峰面积法进行定量分析时，则要求R大于1.25。此外，相邻两组分的响应信号差别越大，所需要的分离度越大。
根据基本色谱分离方程式可知，分离度R是n、k、α的函数，为了讨论方便，假定这三个参数的变化是各自独立的，下面分别考察其对分离度的影响。
基本色谱分离方程式说明分离度与理论塔板数的关系受容量因子、选择因子和柱效的影响。当固定相确定，被分离组分的选择因子确定后，分离度将取决于柱效。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比（见式13.31）。
理论塔板数增加有两条途径：增加柱长和提高柱效。用柱长的色谱柱可以提高分离度。但对一个具体的色谱分离过程来说，除了要求较好的分离度之外，还要求有较快的分析速度。单纯加长色谱柱的长度并不能减小塔板高度，反而延长了分析时间，柱长增加一倍，分析时间和柱压也增加一倍。因此，提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的色谱柱，通过降低塔板高度以提高柱效，进而增加分离度。
根据速率理论，为了提高柱效，首先要采用直径较小、粒度均匀的固定相。对于分配色谱还需控制较薄的液膜厚度。然后需要在适宜的操作条件下工作，如流动相的性质、流速、温度等。
分离度与k
/（k+1）成正比。当k趋近于0时，R也趋于0，组分之间完全不能分离。当k值增大时，k
/（k+1）增大，R也随之增大，对改善分离度有好处。但当k值太大时，k值的增加对R增大的贡献减小，反而由于保留太强，使分析时间大大延长，导致色谱峰扩展严重，有时甚至造成谱带检测的困难（图13.13）。一个良好的色谱分离过程，应将k值控制在合适的范围内。
图13.14 分离度与容量因子及保留时间的关系
从图13.14可见，当k大于5时，R增大变得很缓慢，当k大于10时，R增大不多，但分析时间已经明显延长。曲线的最小值在k为2~3之间。因此，从分离度、分离时间以及对峰的检测灵敏度等方面综合考虑，k的最佳值一般控制在2~5之间。
在气相色谱中，增加固定液的用量可使k值增大，降低柱温，k值也增大，可以通过控制分离的温度达到较好的分离效果。在液相色谱中，对k值的控制通常是通过控制流动相的极性来实现的。对反相色谱而言，流动相极性大，k值小，反之，流动相的极性小，k值增大。
根据分离度方程式，分离度R与（α-1）/α成正比，α越大，则（α-1）/α越大，R越大。当α=1时，R=0，组分之间不能实现分离。与前两者不同的是，α的微小变化会显著的改善分离度。如α从1.1变成1.2时，分离度可以提高一倍，因此增大α值是改善分离度的最有力手段。
但是，选择因子的变化不象柱效和容量因子那样有规律。在气相色谱中，α值主要取决于固定相的性质，并对温度有很大的依赖性，一般降低柱温可使α值增大。在液相色谱中，主要通过改变流动相和固定相的性质来调整α值，温度的作用很小。
从以上分析可知，尽管基本色谱分离方程式的影响因素是已知的，且可以给出改善色谱分离度的方向，但由于各因素对分离度的影响并不是独立的，在实际工作中，还要根据分离的具体情况来对分离度进行优化。同时，在分离度和分析时间之间还应注意平衡，一个良好的色谱分离过程，应具有良好的分离度，同时分析的通量（单位时间内分析的样品数量）还应满足一定的要求。
[例13.1] 在
解：已知，L=
[例13.2] 有一根
图13.15组分1和2的原始分离色谱图
解：可先求得原始分离度R1
13.6 色谱定性和定量分析
不管是气相色谱、液相色谱，它们的定性与定量分析的原理和方法都是基本相同的。
色谱是一种非常高效的分离方法，但是它的定性能力比较弱，不能直接从色谱图中给出定性结果，而需要与已知物对照，或利用色谱文献数据或其他分析方法配合才能给出定性结果。色谱分析定性的方式主要有保留指数定性、利用已知物定性以及仪器联用的方法定性等。
在气相色谱中，可以利用文献中的保留指数数据定性。保留指数随温度的变化率还可用来判断化合物的类型，因为不同类型化合物的保留指数随温度的变化率不同。
保留指数（Retention Index, RI）也称之为科瓦茨（Kovats）指数，是把组分的保留值用两个分别前后靠近它的正构烷烃来标定，由于用到一系列化合物，保留指数比仅用一个参比物质的相对保留值来定性更为精确。正构烷烃的保留指数规定为等于该烷烃分子中碳原子数的 100 倍。例如正己烷的保留指数为600，正庚烷为700，正十五烷为1500。正构烷烃的保留指数与所用的色谱柱，柱温及其它操作条件无关。待定性化合物的保留指数由其相邻的两个正构烷烃的保留指数根据内插法进行计算。
例如，若确定组分X的保留指数IX，可选取两个正构烷烃作为基准物质，其中一个的碳数为Z，另一个为Z+1，它们的调整保留时间分别为t¢R(Z) 和
t¢R(Z+1) ，使被测物质X的调整保留时间t¢R(X)恰好于两者之间，即t¢R(Z) < t¢R(X) < t¢R(Z+1)。将含物质X和所选的两个正构烷烃的混合物注入色谱柱，在一定温度条件下绘制色谱图。大量实验数据表明，化合物调整保留时间的对数值与其保留指数间的关系基本上是一条直线关系。据此，可用内插法求算IX。
（13.32）
图13.16 保留指数的计算
图13.16中，正庚烷的调整保留时间为174，正辛烷的调整保留时间为373.4，而样品乙酸正丁酯的调整保留时间为310，则乙酸正丁酯的保留指数为：
保留指数的物理意义在于：它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。
在色谱定性分析中，最常用的简便可靠的方法是利用已知标准物质比较而进行定性，这个方法的依据是：在确定了固定相和一定的操作条件下，任何物质都有固定的保留值，可作为定性的指标。比较已知物和未知物的保留值是否相同，就可定出某一色谱峰可能是什么物质。
(1)用保留时间或保留体积定性 比较已知和未知物的保留时间或保留体积是否相同，即可决定未知物是什么物质。用此法定性需要在相同的色谱系统下，严格控制色谱条件(柱温、柱长、柱内径、填充量、流速等)和进样量，如果未知物的保留时间与标准物质相同，则可初步认为它们为同一物质，如醇类化合物的保留时间定性分析（图13.17）。为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件（分离柱、流动相、柱温等）或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留时间仍然与标准物质一致，则可认为它们为同一物质。
图13.17 醇类化合物的保留时间定性
(2)利用峰高增加法定性 将已知物加入到未知混合样品中去，若待测组分峰比不加已知物时的峰高增加了，而半峰宽并不相应增加，则表示该混合物中含有已知物的成分。如在废水中五氯苯的分析（图13.18）：
图13.18 废水中利用峰高增加法对五氯苯进行定性分析
(3)利用双柱或多柱定性 严格的讲，仅在一根色谱柱上用以上方法定性是不太可靠的。因有时两种或几种物质在某一色谱柱上具有相同的保留值。此时，用已知物对照定性一般要在两根或多根性质不同的色谱柱上进行对照定性。两色谱柱的固定液要有足够的差别，如一根是非极性固定液，一根是极性固定液，这时不同组分保留值是不一样的，从而保证定性结果可靠。
双柱或多柱定性，主要是使不同组分保留值的差别能显示出来，有时也可用改变柱温的方法，使不同组分保留值差别扩大。
气相色谱能有效地分离复杂的混合物，但不能有效地对未知物定性。而有些分析仪器如质谱、红外等虽是鉴定未知结构的有效工具，定性能力较强，但对复杂的混合物则无法分离、分析。将色谱的分离能力与质谱、红外等分析方法的结构鉴定能力结合起来，实现联机既能将复杂的混合物分离又可同时鉴定结构，是目前仪器分析的一个发展方向，也是近年来色谱分析发展的一个趋势。目前常见的色谱与其他分析仪器连接的技术主要有以下两种。
(1)色谱-质谱联用 质谱仪灵敏度高，扫描速度快，能准确测知未知物相对分子质量，而色谱则能将复杂混合物分离。因此，色-质联用技术是目前解决复杂未知物定性问题的最有效工具之一。常见的色谱-质谱联用方法有气相色谱-质谱（GC-MS）联用，液相色谱-质谱联用（LC-MS）。
(2)色谱-红外光谱联用 纯物质有特征性很高的红外光谱图，并且这些标准图谱已被大量地积累下来，利用未知物的红外光谱图与标准谱图对照则可定性。
除此以外，核磁共振，原子吸收光谱，原子荧光光谱等技术也可以与色谱联用。
色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。
13.6.1 .1 定量校正因子
色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。因此，混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。这样，就不能直接利用峰面积计算物质的含量。为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算是引入定量校正因子。
定量校正因子分为绝对定量校正因子和相对定量校正因子。绝对定量校正因子是指单位峰面积所对应的被测物质的浓度（或质量），即
（13.33）
式中fi值与组分i质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子。在定量分析时要精确求出fi值是比较困难的。一方面由于精确测量绝对进样量困难；另一方面峰面积与色谱条件有关，要保持测定fi值时的色谱条件相同，既不可能又不方便。另外，即便能够得到准确的fi值，也由于没有统一的标准而无法直接应用，因此，常利用相对定量校正因子（简称校正因子）来解决色谱定量分析中的计算问题。
相对定量校正因子定义为
（13.34）
即某组分i的相对定量校正因子fi¢为组分i与标准物质s的绝对定量校正因子之比。
当物质的含量用质量表示时，则所对应的f称为质量校正因子fm。如物质的含量采用物质的量表示，所对应的f称为摩尔校正因子fM。它们分别表示为
或 fm=
（13.35）
fM = 
=
= fm·
（13.36）
式中，Ai，As，mi，ms，Mi，Ms分别代表组分i和标准物质s的峰面积、质量和摩尔质量。
在文献资料中列出的相对校正因子，它们多数是以苯作为标准物质，以热导池为检测器所得的数据；或者是以正庚烷作为标准物质，以氢火焰为检测器所得的数据。也可自行测定相对校正因子fi。测定方法如下：精确称量待测组分和标样，混合后，在实验条件下进行进样分析，分别测量相应的峰面积或峰高，然后按上述有关公式计算出fm或fM。
可见，相对定量校正因子fi¢就是当组分i的质量与标准物质s相等时，标准物质的峰面积是组分i峰面积的倍数。若某组分质量为mi，峰面积Ai，则fi¢ Ai的数值与质量为mi的标准物质的峰面积相等。也就是说，通过相对定量校正因子，可以把各个组分的峰面积分别换算成与其质量相等的标准物质的峰面积，于是比较标准就统一了。这就是归一法求算各组分百分含量的基础。
1.归一化法
归一化法是将所有组分的峰面积Ai分别乘以它们的相对校正因子后求和，把所有出峰组分的含量之和按100%计，即所谓"归一"。假设试样中有n个组分，每个组分的量分别为m1，m2…mn各组分含量总和为m，则组分i的质量分数wi为
（13.37）
式中，f1 ，f2……fn为各组分相应的质量校正因子。
采用归一化法进行定量分析的前提条件是样品中所有成分都要能从色谱柱上洗脱下来，并能被检测器检测。归一法主要在气相色谱中应用。
当f¢i为质量相对校正因子时，得到质量百分数；当f¢i为摩尔相对校正因子时，得到摩尔百分数。
归一化法的优点是简单、准确，操作条件变化时对定量结果影响不大，定量结果与进样量无关。但此法在实际工作中仍有一些限制，比如，样品的所有组分必须全部流出，且出峰。某些不需要定量的组分也必须测出其峰面积及f¢i 值。此外，测量低含量尤其是微量杂质时，误差较大。
当对定量的要求不是很高时，或者样品中各组分的相对校正因子差别不大时，可采用峰面积归一化法。峰面积归一化法就是把所有组分的峰面积相加的总数，用每个组分的峰面积除以这个总面积，即得到此组分的含量。峰面积归一化法的误差主要来自样品中各组分的校正因子差别，因此，不适合于准确定量。但是，当校正因子无法得到，或标准物质无法得到时，用峰面积归一化法可迅速得到组分的大致含量。
（13.38）
2.外标法
外标法是用待测组分的纯品作为标准物质，以标准物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。外标法事实上就是标准曲线法，必须要使用标准物质，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
外标法的测量过程是先将被测组分的标准物质配制成不同浓度的标准溶液，经色谱分析后制作一条标准曲线，即物质浓度与其峰面积（或峰高）的关系曲线。根据样品中待测组分的色谱峰面积（或峰高），从标准曲线上查得相应的浓度。标准曲线的斜率与物质的性质和检测器的特性相关，相当于待测组分的校正因子。
3.内标法
内标法是将已知浓度的标准物质（内标物）加入到未知样品中去，然后比较内标物和被测组分的峰面积，从而确定被测组分的浓度。由于内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰。而且当仪器参数和洗脱条件发生非人为的变化时，内标物和样品组分都会受到同样影响，从而消除了系统误差。当对样品的情况不了解、样品的基体很复杂或不需要测定样品中所有组分时，采用这种方法比较合适。内标法的计算公式如下：
校正因子
（13.39）
式中mis为标准样品量；m0为内标物量；Ais为标准样品峰面积(或峰高)；A0为内标物峰面积(或峰高)。
（13. 40）
式中 mi为样品质量；m0为测定样品时内标物的质量；Ai为样品峰面积(或峰高)；A0为内标物峰面积(或峰高)。
内标法中内标物的选择应满足一定的要求。首先，内标物必须是试样中不存在的物质，内标物色谱峰能与各待测组分的色谱峰完全分离，且保留时间相近。其次，在所给定的色谱条件下具有一定的化学稳定性、与样品不发生化学反应。内标物在样品中必须具有很好的溶解性，浓度适当、分析灵敏度与待测组分相近。
为了进行大批样品的内标法分析，必需要建立校正曲线。具体操作方法是用待测组分的纯物质配制成不同浓度的标准溶液，然后在等体积的这些标准溶液中分别加入浓度相同的内标物,混合后注入色谱柱进行分析。以待测组分的浓度为横坐标，待测组分与内标物峰面积（或峰高）的比率为纵坐标建立标准曲线（或线性方程）。在分析未知样品时，分别加入与绘制标准曲线时同样体积的样品溶液和同样浓度的内标物，用样品与内标物峰面积（或峰高）的比值，在标准曲线上查出被测组分的浓度或用线性方程计算。
同位素内标法在色谱-质谱联用分析中有一定的应用。同位素内标法是使用待测组分的氘代异构体作为内标物，由于其色谱行为与待测组分完全一致，而且可以利用质谱仪进行分别定量，是最理想的内标法，但其价格非常昂贵，应用受到一定限制。
思考题与习题
13.1试按流动相和固定相的不同将色谱分析分类。
13.2 欲使两种组分分离完全，必须符合什么要求？这些要求各与何种因素有关?
13.3
色谱柱的理论塔板数很大，能否说明两种难分离组分一定能分离?为什么?
13.4 范弟姆特方程式主要说明什么问题?试讨论之。
13.5
分离度R和相对保留值r2,1这两个参数中哪一个更能全面地说明两种组分的分离情况?为什么?
13.6
“用纯物质对照进行定性分析时，未知物与纯物质的保留时间相同，则未知物就是该纯物质”。这个结论是否可靠？应如何处理这一问题?
13.7
什么是内标法、外标法、归一化法?它们的应用范围和优缺点各有什么不同？
13.8
色谱图上有两个色谱峰，它们的保留时间和峰底宽度分别为tR1=3.5 min，tR2=3.9 min，W1=0.2 min，W2=0.45 min。已知死时间t0=0.5 min。求这两个色谱峰的相对保留值r2,1和分离度R。
13.9
分析某试样时，两种组分的相对保留值r2,1 = 1.16，柱的有效塔板高度H =
13.10
在某色谱条件下，分析只含有二氯乙烷，二溴乙烷及四乙基铅三组分的样品，结果如下：
|
|
二氯乙烷 |
二溴乙烷 |
四乙基铅 |
|
相对质量校正因子 |
1.00 |
1.65 |
1.75 |
|
峰面积cm2 |
1.50 |
1.01 |
2.82 |
试用归一化法求各组分的百分含量。
13.11
物质A、B二组分在